一、背景介绍

本试剂盒是用来定量分析以毕赤酵母（Pichia Pastoris，适用菌株X-33）为表达系统时，蛋白药物中宿主细胞残留蛋白。

 毕赤酵母作为常用的表达系统在表达目的蛋白的同时，会伴随着表达细胞自身凋亡，资料显示细胞破碎后释放到培养基中的宿主蛋白达上千种之多，其中很大一部分具有很强的免疫原性，导致不良的毒性或免疫反应而危及产品安全和质量，造成潜在的生物污染，生物医药产品生产下游过程的目的之一就是移除这些潜在危害。

因此，非常有必要将宿主细胞蛋白（HCP）残留量降低到最低水平，在研发下游纯化的工艺时，必须具有一种科学合理的测定成品或者半成品中HCP浓度的方法，而酶联免疫法具有极高灵敏度，因而被FDA,EMA,CFDA及ICH等国内外监管机构定为HCP检测的金标准。

二、实验原理

本试剂盒采用了固相夹心法的酶联免疫吸附实验（ELISA）。先将捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体。检测时在包被抗体的微孔板中先加入待测抗原孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，形成包被抗体-抗原-检测抗体复合物。经洗涤后去除未参与反应的结合物，最后加入底物TMB显色。TMB在HRP的氧化作用下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。氧化后的TMB颜色和因子的总含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与浓度拟合成标准曲线，通过样本OD值，代入标准曲线方程，计算样品中因子浓度。

三、试剂盒优势

1. 覆盖度广：抗体有较强的识别HCP能力，覆盖度80%以上，工艺稳定。

2. 抗体滴度高：试剂盒中使用的抗体，经Elisa检测抗血清效价在106。

3. 灵敏度高：独特的血清纯化工艺，最大限度去除非特异性抗体。

4. 稳定性高：生产过程采用广谱蛋白稳定剂，和微孔板处理工艺，增加标准品及微孔板热稳定性和结果的可重复性。

5. 稀释液优化：针对抗体纯化各个阶段使用的缓冲液不同优化样本稀释液，可显著降低样本检测过程中非特异性吸附，提高样本稀释线性及回收率，本底显色极低利于观察待测样本浓度。

四、试剂盒组分

五、实验需要但未提供的耗材及设备

六、实验前的准备

请仔细阅读试剂盒说明书，反应在室温下进行。

七、试剂的准备

1. 试剂盒内所有试剂及包被板，请在使用前30分钟拿出，使其恢复室温。

2. 洗液的稀释：将10mL 100×洗液母液，加入990mL去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。

3. 稀释液的准备：将10mL 10×稀释液母液，加入90mL去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解，用作标准品，样品，检测抗体的稀释液。

八、操作步骤

1. 撕开包装袋，取出包被有抗体的酶标板，拆下不需要使用的板条，并用封板膜封好，放回铝箔袋，重新放回4℃保存（板架可重复使用）。标准品由于运输颠簸可能会粘在管壁上，使用前轻微甩匀，或在离心机上离心2秒左右。

2. 标准品的稀释：提前标记8只样品稀释管，预加入一定体积的稀释液，其中IS（46μL），S1（490μL），S2至S6（各250μL），S7（300μL）。取标准品母液（浓度为500μg/mL）4μL加入到标记为IS的管，轻轻吹打2次并颠倒混匀即可（后续操作相同，切勿涡旋等剧烈混匀），接着吸取10μL浓度为40μg/mL的IS到S1管，混匀后，取250μL浓度为800ng/mL的标准品S1到下一管,之后以2倍梯度稀释至S6，最后从S6中吸取100μL加入S7中混匀即可（稀释过程如下图）。

注：标准曲线有7个点，分别命名为S1、S2、S3……S7。其中S1即标准曲线的最高浓度点（800ng/mL）。

3. 将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5小时。

4. 洗板机洗板：

Ø 取出稀释好的洗液放置于洗板机的洗瓶中备用。

Ø 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液体，洗板机洗板5次。

Ø 洗板完成后，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打，充分拍干至无明显水膜为止。

或手动洗板：

Ø 取出稀释好的洗液放置于洗瓶中备用。

Ø 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液体，在吸水纸上轻轻拍打至无明显液滴。

Ø 用多道移液枪向每个微孔中加300μL洗液，静置20秒，倒去洗液，将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻拍打。重复5次。注：第五次洗板时，充分拍干至无明显水膜为止。

5. 检测抗体：取检测抗体母液（100×）100μL到10mL稀释液中稀释至工作浓度（1×），取100μL加入到各微孔中，将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5小时。

6. 洗板：重复步骤4。

7. 显色：各微孔板加入100μL TMB溶液，室温反应15分钟左右。若颜色浅可适当延长反应时间，勿超过30分钟。

8. 终止：各微孔中加入50μL终止液，终止反应。

9. 读取OD值：在波长450nm下读取OD值。

10. 数据分析：推荐使用四参数回归拟合。

九、注意事项

（一）样本收集注意事项

1. 样本收集完毕后，要分装保存在-20℃（少于3个月）或-80℃（少于6个月）以保持蛋白活性，避免污染和反复冻融。如果要在24小时内分析样本，可以保存在2-8℃。

2. 冷冻样本使用前请保证充分化冻（请勿加热融化样本），使用前用移液器或者Vortex混匀，样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰，可离心去除。

3. 某些化学裂解液（如SDS，Triton等）可能会对本实验造成干扰，谨慎使用。

4. 建议所有标准品及样本都设置复孔。向微孔中加入样本，保证不要有气泡。

5. 目标蛋白纯化过程通常伴随成分复杂的缓冲液，建议首次使用不同缓冲液时进行加标回收，以排除基质干扰效应，可接受的加标回收率为80-120%。通常，高盐、低pH、多糖、有机溶剂及去污剂会导致较低回收率。通常做法是，将稀释后的标准品S1（800ng/mL）与待测试溶液基质按照1：3体积混合（如25μL含/不含浓度为800ng/mL的标准品S1加入75μL待测溶液），计算时用加标后浓度减去加标前本底浓度，再除以理论浓度即为加标回收率。

（二）实验操作注意事项

1. 请不要将本试剂盒的试剂与其他试剂盒试剂交叉使用。

2. 实验操作使用一次性吸头，避免交叉污染。

3. 加样：加样时要控制时间和速度，一般加样时间控制在10分钟内。如果样本数量过多，可使用多道移液器。

4. 洗涤：洗涤时微孔中残留的洗涤液应在吸水纸上充分拍干，并要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响最后的酶标仪读数。

5. 由于底物TMB溶液是光感性的试剂，使用前请勿长时间暴露于可见光下。同时要避免TMB与金属接触。

6. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。

7. 本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。

8. 标准曲线的R²≥0.95。

9. 拍板示意图:

十、数据处理

1. 对样本及标准品各自对应的复孔OD值取平均值。

2. 以标准品的OD作为Y值，标准品的浓度作为X值，推荐选择四参数logistic（4-PL）曲线拟合。

3. 将样本OD代入到标准曲线方程中计算样本中待检样本的浓度。

4. 以下曲线仅供参考。

附件一、标准曲线实例

十一、试剂盒质量控制

1. 灵敏度：

最低检测限（LOD）：1.56ng/mL

最低定量限（LOQ）：6.25ng/mL

2. 精密度

批内差CV%：7-11

批间差CV%：1.1-5.8

3. 线性