一、背景介绍

本试剂盒是用来定量分析以大肠杆菌（E.coli）为表达系统时，蛋白药物中宿主细胞残留蛋白。 大肠杆菌被广泛用来作为表达系统，在破碎菌体提取目标蛋白过程中，很大一部分宿主蛋白与目的蛋白一起释放，该宿主蛋白具有很强的免疫原性，导致不良的毒性或免疫反应而危及产品安全和质量，造成潜在的生物污染，生物医药产品生产下游过程的目的之一就是移除这些潜在危害。因此，非常有必要将宿主细胞蛋白（HCP）残留量降低到最低水平，在研发下游纯化的工艺时，必须具有一种科学合理的测定成品或者半成品中HCP浓度的方法，而酶联免疫法具有极高灵敏度，因而被监管机构定为HCP检测的金标准。

二、实验原理

本试剂盒采用了固相夹心法的酶联免疫吸附实验（ELISA）。先将捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体。检测时在包被抗体的微孔板中先加入待测抗原孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，形成包被抗体-抗原-检测抗体复合物。经洗涤后去除未参与反应的结合物，最后加入底物TMB显色。TMB在HRP的氧化作用下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。氧化后的TMB颜色和因子的总含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与浓度拟合成标准曲线，通过样本OD值，代入标准曲线方程，计算样品中因子浓度。

三、试剂盒优势

(1) 覆盖度广：包被抗体及检测抗体均为种属兔来源，有较强的识别HCP能力，且该种属个体间差异小，具有高度可比性，工艺稳定。

(2) 抗体滴度高：试剂盒中使用的抗体，间接法Elisa检测抗血清效价达106。

(3) 灵敏度高：血清抗体纯化采用亲和纯化，最大限度去除非特异性抗体。

(4) 稳定性高：生产过程采用广谱蛋白稳定剂，和微孔板处理工艺，增加标准品及微孔板热稳定性和结果的可重复性。

(5) 稀释液优化：使用优化稀释液，可降低样本检测过程中非特异性吸附，本底显色极低利于观察待测样本浓度。

四、实验材料及仪器准备

1. 试剂盒内容（2-8℃冷藏）

五、实验需要但试剂盒未提供的材料 

1) 10-1000μl移液器及一次性灭菌吸头

2) 多道移液器

3) 灭菌的去离子水或超纯水1L

4) 灭菌EP管

5) 吸水纸

6) 酶标仪

7) 高速离心机

8) 洗板机或者洗瓶

9) 数据分析及绘图软件

六、样本收集

收集培养的菌体，5000-7000rpm离心10分钟，弃上清，加入含溶菌酶的高渗缓冲液后经超声破碎，再次离心，上清溶液于-20℃或-80℃分装保存备用。

样本准备注意事项：

u 样本收集完毕后，要分装保存在-20°C (少于3个月) 或-80°C (少于6个月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反复冻融，如果要在24小时内分析样本，可以保存在2- 8°C。

u 某些化学裂解液可能会对本实验造成干扰，比如SDS，Triton，谨慎使用。

u 样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰，务必离心去除。

u 不能加热来融化样本。

七、实验前的准备

请仔细阅读试剂盒说明书，反应在室温下进行。

八、试剂的准备

1) 试剂盒内所有试剂及包被板，请在使用前的30min拿出，使其恢复室温。

2) 洗液的稀释：将10ml 100×洗液母液，加入990ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。

3) 稀释液的准备：将10ml 10×稀释液母液，加入90ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。将含量为0.5g的稀释液组分全部加入到100ml的1X稀释液中，溶解并混匀，用作标准品，样品，检测抗体的稀释液。

九、操作步骤

1. 撕开包装袋，取出包被有抗体的酶标板，拆下不需要使用的板条，并用封口膜封好，放回铝箔袋，重新放回4℃保存（板架可重复使用）。标准品由于运输颠簸可能会粘在管壁上，使用前轻微甩匀，或在离心机上离心2秒左右。

2. 标准品的稀释：

配置标曲时提前标记7只样品稀释管，预加入一定体积的稀释液，其中S1(780ul),S2至S7(各250ul)

取标准品母液（浓度为10ug/ml）20ul加入到标记为S1的管，震荡混匀后，接着吸取250ul浓度为250ng/ml的标准品S1到下一管,之后以2倍梯度稀释至S7（稀释过程如下图）。从稀释好后的标准曲线各浓度点分别取100ul加入空白微孔中，样本（原液或稀释液）取100ul加入空白微孔中。空白对照(Blank Control)加入100ul的样本稀释液即可。

注：标准曲线有7个点，分别命名为S1、S2、S3……S7。其中S1即标准曲线的最高浓度点（250ng/ml）。

3. 将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5h。

4. 洗板机洗板：

Ø 取出稀释好的洗液放置于洗板机的洗瓶中备用。

Ø 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液体，洗板机洗板5次。

Ø 洗板完成后，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打，充分拍干至无明显水膜为止。

或手动洗板：

Ø 取出稀释好的洗液放置于洗瓶中备用。

Ø 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液体，在吸水纸上轻轻拍打至无明显液滴。

Ø 用多道移液枪向每个微孔中加300ul洗液，静置20s，倒去洗液，将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻拍打。重复5次。注：第五次洗板时，充分拍干至无明显水膜为止。

5. 检测抗体：取检测抗体母液(100×)100ul到9.9ml稀释液中稀释至工作浓度(1×)，取100ul加入到各微孔中，将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5h。

6. 洗板：重复步骤4。

7. 显色：各微孔板加入100ul TMB溶液，室温反应15min左右。若颜色浅可适当延长反应时间，勿超过30min。

8. 终止：各微孔中加入50ul终止液，终止反应。

9. 读取OD值：在波长450nm下读取OD值。

10. 数据分析：推荐使用四参数回归拟合。

十、注意事项

（一）样本收集注意事项

1、样本收集完毕后，要分装保存在-20℃（少于3个月）或-80℃（少于6个月）以保持蛋白活性，避免污染和反复冻融。如果要在24小时内分析样本，可以保存在2-8℃。

2、采集样本后如果短期内不使用，请将样本分装后冷冻保存，避免反复冻融。冷冻样本使用前请保证充分化冻，使用前用移液器或者Vortex混匀，可离心除去絮状不溶物。

3、建议所有标准品及样本都设置复孔。向微孔中加入试剂或样本后，请轻轻震荡使液体混匀，并尽量保证不要有气泡。

4、目标蛋白纯化过程通常伴随成分复杂的缓冲液，建议首次使用不同缓冲液时进行加标回收，以排除基质干扰效应。通常，高盐、低pH、多糖、有机溶剂及去污剂会导致较低回收率。

通常做法是，将稀释后的标准品S1（250ng/ml）与待测试溶液基质按照1：4体积混合（如20ul含/不含浓度为250ng/ml的标准品S1加入80ul待测溶液），计算时用加标后浓度减去加标前本底浓度。

（二）实验操作注意事项

1、请不要将本试剂盒的试剂与其他试剂盒试剂交叉使用。

2、实验操作使用一次性吸头，避免交叉污染。

3、加样：加样时要控制时间和速度，一般加样时间控制在10分钟内。如果样本数量过多，可使用多道移液器。

4、洗涤：洗涤时微孔中残留的洗涤液应在吸水纸上充分拍干，并要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响最后的酶标仪读数。

5、由于底物TMB溶液是光感性的试剂，使用前请勿长时间暴露于可见光下。同时要避免TMB与金属接触。

6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。

7、本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。

8、标准曲线的R²≥0.95。

9、拍板示意图:

十一、数据处理

1) 对样本及标准品各自对应的复孔OD值取平均值。

2) 以标准品的OD作为Y值，标准品的浓度作为X值，推荐选择四参数logistic (4-PL) 曲线拟合。

3) 将样本OD代入到标准曲线方程中计算样本中待检样本的浓度。

4) 以下曲线仅供参考。

附件一、标准曲线实例

HCP 标准曲线

十二、试剂盒质量控制

1）批内差CV%: 7.3-13.1

2）批间差CV%: 8.1-11.5

3）线性:

4）灵敏度:

最低检测限(LOD)：1.95ng/ml

最低定量限(LOQ)：3.9ng/ml