一、背景介绍

免疫球蛋白（Ig）是一组具有特殊的化学结构和免疫功能的球蛋白，存在于体液内和淋巴细胞表面，是抗体的物质基础。按结构和功能的不同分为五大类:IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。其分子大小、电荷、氨基酸组成和碳水化合物含量很不均一。Ig分子具有结合抗原和刺激抗体生成的双重功能。IgG是血清中免疫球蛋白主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75%，正常值为9.5~12.5mg/ml。其中40～50%分布于血清中，其余分布在组织中。正常人的IgG包括四个亚型，即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。这些亚型在补体激活的过程中结合能力各不相同。

二、实验原理

本试剂盒采用酶联免疫吸附实验双抗夹心法检测样本中人 IgG的浓度。首先将样本或者标准品加入预包被有山羊抗人抗体的微孔中，利用抗原抗体特异性结合的特点在特定条件下孵育，使样本及标准品中的IgG被捕获于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未结合的物质，加入偶联生物素的山羊抗人抗体，37℃条件下孵育，使包被抗体、人IgG及检测抗体形成双抗夹心复合物。洗板，再加入偶联亲和素的HRP，产生级联放大效应。最后加入显色底物溶液。显色结束后，加入硫酸溶液终止反应，颜色由蓝色变成黄色。样本或者标准品中IgG的含量与显色颜色深浅成正比，据此可以计算待检样本中人 IgG的含量。

三、试剂盒改进

(1) 特异性高：包被抗体与检测抗体分别识别同一抗原的不同特异性表位，增加了反应的特异性。同类细胞因子之间没有交叉反应。

(2) 敏感性高：检测抗体偶联生物素，与亲和素之间多价高亲和力，级联放大效应使得实验敏感度增加。

(3) 稳定性高：实验采用的是优质的包被抗体和抗原，并使用了特定的广谱蛋白稳定剂，和微孔板处理工艺，增加微孔板热稳定性和结果的可重复性。

(4) 样本稀释液优化：使用针对人血清样本优化后的特异性的缓冲液，排除样本基质干扰，适用于血清，血浆等常规样本的细胞因子定量检测。

四、提供的试剂及材料 

请将请按照试剂标签提示的贮存条件存放试剂，并请在保质期前使用。

五、实验需要但试剂盒未提供的材料 

1) 10-1000 μl移液器及一次性灭菌吸头

2) 多道移液器

3) 灭菌的去离子水或超纯水1L

4) 灭菌EP管

5) 吸水纸

6) 酶标仪

7) 高速离心机

8) 洗板机或者洗瓶

9) 恒温箱或水浴锅 (37℃)

10) 数据分析及绘图软件

11) PBS(pH 7.4)的配制比例：NaH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，用蒸馏水稀释至 1000mL。

六、样本收集和保存

1) 血清：血液采集时不加抗凝剂，室温静置1-2小时，1000×g（或3000rpm）离心15分钟，取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。

2) 血浆：血液采集时要加入总体积1%的抗凝剂（EDTA、肝素等），采集后先室温或4℃静置半小时后，1000×g（或3000rpm）离心15分钟，取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。

3) 组织裂解液：组织裂解的方式取决于组织的类型，一般来讲，先用预冷的PBS清洗组织后称重。一般0.3g-0.5g组织加入500μL预冷的PBS，在冰上的玻璃容器内研碎。用超声或者反复冻融的方法裂解细胞膜，1500×g（或5000rpm）离心15分钟分钟后取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。

4) 细胞裂解液：悬浮细胞直接离心取细胞沉淀。贴壁细胞需用胰酶消化后离心取细胞沉淀。检测某些指标时不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重悬细胞，超声或者反复冻融的方法裂解细胞膜，1500×g（或5000rpm）离心15分钟分钟后取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。

5) 细胞上清液：收集培养的细胞，1000×g（或3000rpm）离心15分钟，取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。

样本准备注意事项：

u 样本收集完毕后，要分装保存在-20°C (少于3个月) 或-80°C (少于6个月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反复冻融 如果要在24小时内分析样本，可以保存在2- 8°C。

u 某些化学裂解液可能会对本实验造成干扰，比如SDS，Triton。谨慎使用。

u 样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰，务必离心去除。

u 不要使用高脂血或溶血的样本，对ELISA有干扰，导致检测结果不准确。

u 不能加热来融化样本。

七、实验前的准备 

1) 请仔细阅读试剂盒说明书，将水浴锅或恒温箱温度设置为37℃。

2) 样本的准备：将化冻后的冻存样本，混匀后，12000rpm离心1min，取上清作为待检样本备用。

3) 样本的稀释倍数：如果您的样本预测浓度高于本试剂盒最高检测限度，建议使用PBS对样本进行稀释。根据实验室建议，一般情况下至少稀释倍数100万倍，可根据实际情况调整稀释倍数。

注意:

u 若预估待测样本浓度超出试剂盒最高检测限度，请进行预实验以确定样本稀释倍数。

u 若您使用说明书中未列举的样本，请进行预实验看本试剂盒是否适合您的实验。

u 由于在细胞稳定性，细胞数目，及采样时间上存在差异，细胞培养上清样本可能无法被本试剂盒检测。

u 建议您使用新鲜的或者储存时间不长的样本用于分析测试。否则，样本中蛋白质的降解及变性会导致错误的实验结果。

u 实验样本的最佳PH值在7.0-7.4之间。

八、试剂的准备

1) 试剂盒内所有试剂及包被板，请在使用前的30min拿出，使其恢复室温。

2) 洗液的稀释：量取10ml 100×洗液母液，加入990ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以稳定保存2周。

3) 样本的准备：将化冻后的冻存样本，混匀后，12000rpm离心1min，取上清作为待检样本备用。

九、实验步骤

1) 撕开包装袋，取出包被有抗体的酶标板，拆下不需要使用的板条，并用封口膜封好，放回铝箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重复使用）

2) 向微孔板中加入8个标准品各100ul，向其余微孔中加入100ul的准备好的分析样本溶液。贴上封口膜，37℃孵育1.5h。

3) 洗板机洗板：

Ø 取出稀释好的洗液放置于洗板机的洗瓶中备用。

Ø 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液体，洗板机洗板5次。

Ø 洗板完成后，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打，充分拍干至无明显水膜为止。

或手动洗板：

Ø 取出稀释好的洗液放置于洗瓶中备用。

Ø 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液体，在吸水纸上轻轻拍打至无明显液滴。

Ø 用多道移液枪向每个微孔中加300ul洗液，静置20s，倒去洗液，将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻拍打。重复5次。注：第五次洗板时，充分拍干至无明显水膜为止。

4) 加检测抗体：取420ul检测抗体母液（25×）加入对应的稀释液瓶中，轻轻震荡混匀，使其充分稀释至工作浓度后（1×），各孔加100ul溶液，贴上封口膜，37℃孵育1h。然后洗板，按步骤3操作。

5) 加入HRP：取52.5ul HRP母液（200×）加入对应的稀释液瓶中，轻轻震荡混匀，使其充分稀释至工作浓度后（1×），各孔加100ul溶液，贴上封口膜，37℃孵育45min。然后洗板，按步骤3操作。

6) 显色：向每个孔中加入100ul底物TMB，轻轻震荡30s混匀，贴上封口膜，置于避光的37℃恒温培养箱中显色10-30min。

注：震荡速度要低于100rpm，液体溅出会影响后续OD值。显色时间因实验室条件（温度、湿度等）会有一定差异。

7) 显色终止及读板：直接向含有底物的微孔中加入50ul的终止液，终止反应，轻轻震荡混匀，立即转移到酶标仪上，在450nm下读取吸光度值。

十、注意事项

（一）样本收集注意事项

1、样本收集完毕后，要分装保存在-20℃（少于3个月）或-80℃（少于6个月）以保持蛋白活性，避免污染和反复冻融。如果要在24小时内分析样本，可以保存在2-8℃。

2、采集样本后如果短期内不使用，请将样本分装后冷冻保存，避免反复冻融。冷冻样本使用前请保证充分化冻，使用前用移液器或者Vortex混匀，可离心除去絮状不溶物。

3、若母液（标准品，检测抗体及酶液）出现浑浊，轻轻振荡或吹打即可。

4、建议所有标准品及样本都设置复孔。向微孔中加入试剂或样本后，请轻轻震荡使液体混匀，并尽量保证不要有气泡。

5、高脂血或溶血的样本含有丰富的过氧化物酶，对ELISA有干扰，导致检测结果非特异性升高，不建议使用。

（二）实验操作注意事项

1、请不要将本试剂盒的试剂与其他试剂盒试剂交叉使用。

2、实验操作使用一次性吸头，避免交叉污染。

3、加样：加样时要控制时间和速度，一般加样时间控制在10分钟内。如果样本数量过多，可使用多道移液器。

4、洗涤：洗涤时微孔中残留的洗涤液应在吸水纸上充分拍干，并要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响最后的酶标仪读数。

5、由于底物TMB溶液是光感性的试剂，使用前请勿长时间暴露于可见光下。同时要避免TMB与金属接触。

6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。

7、本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。

8、标准曲线的R²≥0.95。

9、拍板示意图:

十一、数据处理

1) 对样本及标准品各自对应的复孔OD值取平均值。减去空白孔（即S8）OD值后带入标曲。

2) 以标准品的OD作为Y值，标准品的浓度作为X值，推荐选择四参数logistic (4-PL) 曲线拟合。

3) 将样本OD代入到标准曲线方程中计算样本中待检IgG的浓度。

4) 以下曲线仅供参考。

附件一、标准曲线实例

人IgG标准曲线

十二、质量控制

1) 批内差CV%: 2.7-3.14

2) 批间差CV%: 8.4-9.6

3) 回收率%: 88.77-113.22

4) 线性: 

5) 灵敏度: 10.2 pg/ml

6) 特异性/交叉反应性: 

7) 勾状效应（Hook Capacity）

本试剂盒是一个三步法的夹心ELISA试剂盒，样本在高含量IgG的情况下会受到钩状效应的影响。请用试剂盒稀释液稀释样本，使其IgG浓度在本试剂盒的检测范围以内。

8) 局限性

本试剂盒不适用于含有叠氮化钠(NaN3)的样本，因为叠氮化钠是HRP的强抑制剂，会降低检测到目的蛋白的浓度。

应用：定量检测小鼠血清、血浆、细胞液、体液以及组织匀浆中IgG的含量

用途：本试剂盒仅供科研使用，不得用于临床及诊断使用！