一、背景介绍
免疫球蛋白(Ig)是一组具有特殊的化学结构和免疫功能的球蛋白,存在于体液内和淋巴细胞表面,是抗体的物质基础。按结构和功能的不同分为五大类:IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。其分子大小、电荷、氨基酸组成和碳水化合物含量很不均一。Ig分子具有结合抗原和刺激抗体生成的双重功能。IgG是血清中免疫球蛋白主成分,约占血清中免疫球蛋白总含量的75%,正常值为9.5~12.5mg/ml。其中40~50%分布于血清中,其余分布在组织中。正常人的IgG包括四个亚型,即IgG1,IgG2,IgG3,IgG4。这些亚型在补体激活的过程中结合能力各不相同。
二、实验原理
本试剂盒采用酶联免疫吸附实验双抗夹心法检测样本中人 IgG的浓度。首先将样本或者标准品加入预包被有山羊抗人抗体的微孔中,利用抗原抗体特异性结合的特点在特定条件下孵育,使样本及标准品中的IgG被捕获于聚丙烯微孔板上。然后洗板,洗去其它未结合的物质,加入偶联生物素的山羊抗人抗体,37℃条件下孵育,使包被抗体、人IgG及检测抗体形成双抗夹心复合物。洗板,再加入偶联亲和素的HRP,产生级联放大效应。最后加入显色底物溶液。显色结束后,加入硫酸溶液终止反应,颜色由蓝色变成黄色。样本或者标准品中IgG的含量与显色颜色深浅成正比,据此可以计算待检样本中人 IgG的含量。
三、试剂盒改进
(1) 特异性高:包被抗体与检测抗体分别识别同一抗原的不同特异性表位,增加了反应的特异性。同类细胞因子之间没有交叉反应。
(2) 敏感性高:检测抗体偶联生物素,与亲和素之间多价高亲和力,级联放大效应使得实验敏感度增加。
(3) 稳定性高:实验采用的是优质的包被抗体和抗原,并使用了特定的广谱蛋白稳定剂,和微孔板处理工艺,增加微孔板热稳定性和结果的可重复性。
(4) 样本稀释液优化:使用针对人血清样本优化后的特异性的缓冲液,排除样本基质干扰,适用于血清,血浆等常规样本的细胞因子定量检测。
四、提供的试剂及材料
请将请按照试剂标签提示的贮存条件存放试剂,并请在保质期前使用。
名称 | 规格 | 数量 | 保存 | |
1 | 已包被平底微孔板 | 96孔 | 1板(可拆卸) | 2-8℃密封冷藏 |
2 | 标准品S1 | 10000pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
3 | 标准品S2 | 5000pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
4 | 标准品S3 | 2500pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
5 | 标准品S4 | 1250pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
6 | 标准品S5 | 625pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
7 | 标准品S6 | 312.5pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
8 | 标准品S7 | 156.25pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
9 | 标准品S8 | 0pg/ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
10 | 检测抗体母液(25×) | 500ul | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
11 | 检测抗体稀释液 | 10.5ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
12 | 酶液(HRP,200×) | 80ul | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
13 | 酶稀释液 | 10.5ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
14 | TMB | 10.5ml | 1瓶 | 2-8℃避光冷藏 |
15 | 终止液 | 500ul | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
16 | 洗液(100×) | 10.5ml | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
17 | 封口膜 | 4张 | ||
18 | 使用说明书 | 1份 |
五、实验需要但试剂盒未提供的材料
2) 多道移液器
3) 灭菌的去离子水或超纯水1L
4) 灭菌EP管
5) 吸水纸
6) 酶标仪
7) 高速离心机
8) 洗板机或者洗瓶
10) 数据分析及绘图软件
11) PBS(pH 7.4)的配制比例:NaH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,NaCl 8g,KCl 0.2g,用蒸馏水稀释至 1000mL。
六、样本收集和保存
1) 血清:血液采集时不加抗凝剂,室温静置1-2小时,1000×g(或3000rpm)离心15分钟,取上清,-20℃或-80℃分装保存备用。
2) 血浆:血液采集时要加入总体积1%的抗凝剂(EDTA、肝素等),采集后先室温或4℃静置半小时后,1000×g(或3000rpm)离心15分钟,取上清,-20℃或-80℃分装保存备用。
3) 组织裂解液:组织裂解的方式取决于组织的类型,一般来讲,先用预冷的PBS清洗组织后称重。一般0.3g-0.5g组织加入500μL预冷的PBS,在冰上的玻璃容器内研碎。用超声或者反复冻融的方法裂解细胞膜,1500×g(或5000rpm)离心15分钟分钟后取上清,-20℃或-80℃分装保存备用。
4) 细胞裂解液:悬浮细胞直接离心取细胞沉淀。贴壁细胞需用胰酶消化后离心取细胞沉淀。检测某些指标时不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重悬细胞,超声或者反复冻融的方法裂解细胞膜,1500×g(或5000rpm)离心15分钟分钟后取上清,-20℃或-80℃分装保存备用。
5) 细胞上清液:收集培养的细胞,1000×g(或3000rpm)离心15分钟,取上清,-20℃或-80℃分装保存备用。
样本准备注意事项:
u 样本收集完毕后,要分装保存在-20°C (少于3个月) 或-80°C (少于6个月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反复冻融 如果要在24小时内分析样本,可以保存在2- 8°C。
u 某些化学裂解液可能会对本实验造成干扰,比如SDS,Triton。谨慎使用。
u 样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰,务必离心去除。
u 不要使用高脂血或溶血的样本,对ELISA有干扰,导致检测结果不准确。
u 不能加热来融化样本。
七、实验前的准备
1) 请仔细阅读试剂盒说明书,将水浴锅或恒温箱温度设置为37℃。
2) 样本的准备:将化冻后的冻存样本,混匀后,12000rpm离心1min,取上清作为待检样本备用。
3) 样本的稀释倍数:如果您的样本预测浓度高于本试剂盒最高检测限度,建议使用PBS对样本进行稀释。根据实验室建议,一般情况下至少稀释倍数100万倍,可根据实际情况调整稀释倍数。
注意:
u 若预估待测样本浓度超出试剂盒最高检测限度,请进行预实验以确定样本稀释倍数。
u 若您使用说明书中未列举的样本,请进行预实验看本试剂盒是否适合您的实验。
u 由于在细胞稳定性,细胞数目,及采样时间上存在差异,细胞培养上清样本可能无法被本试剂盒检测。
u 建议您使用新鲜的或者储存时间不长的样本用于分析测试。否则,样本中蛋白质的降解及变性会导致错误的实验结果。
u 实验样本的最佳PH值在7.0-7.4之间。
八、试剂的准备
1) 试剂盒内所有试剂及包被板,请在使用前的30min拿出,使其恢复室温。
2) 洗液的稀释:量取10ml 100×洗液母液,加入990ml去离子水或超纯水,混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶,请将其置于室温,并轻轻震荡至晶体完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以稳定保存2周。
3) 样本的准备:将化冻后的冻存样本,混匀后,12000rpm离心1min,取上清作为待检样本备用。
九、实验步骤
1) 撕开包装袋,取出包被有抗体的酶标板,拆下不需要使用的板条,并用封口膜封好,放回铝箔袋,重新放回4℃保存。(板架可重复使用)
2) 向微孔板中加入8个标准品各100ul,向其余微孔中加入100ul的准备好的分析样本溶液。贴上封口膜,37℃孵育1.5h。
3) 洗板机洗板:
Ø 取出稀释好的洗液放置于洗板机的洗瓶中备用。
Ø 取出上步中的微孔,甩去微孔中的液体,洗板机洗板5次。
Ø 洗板完成后,将微孔板倒扣在吸水纸上拍打,充分拍干至无明显水膜为止。
或手动洗板:
Ø 取出稀释好的洗液放置于洗瓶中备用。
Ø 取出上步中的微孔,甩掉微孔中的液体,在吸水纸上轻轻拍打至无明显液滴。
Ø 用多道移液枪向每个微孔中加300ul洗液,静置20s,倒去洗液,将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻拍打。重复5次。注:第五次洗板时,充分拍干至无明显水膜为止。
4) 加检测抗体:取420ul检测抗体母液(25×)加入对应的稀释液瓶中,轻轻震荡混匀,使其充分稀释至工作浓度后(1×),各孔加100ul溶液,贴上封口膜,37℃孵育1h。然后洗板,按步骤3操作。
5) 加入HRP:取52.5ul HRP母液(200×)加入对应的稀释液瓶中,轻轻震荡混匀,使其充分稀释至工作浓度后(1×),各孔加100ul溶液,贴上封口膜,37℃孵育45min。然后洗板,按步骤3操作。
6) 显色:向每个孔中加入100ul底物TMB,轻轻震荡30s混匀,贴上封口膜,置于避光的37℃恒温培养箱中显色10-30min。
注:震荡速度要低于100rpm,液体溅出会影响后续OD值。显色时间因实验室条件(温度、湿度等)会有一定差异。
7) 显色终止及读板:直接向含有底物的微孔中加入50ul的终止液,终止反应,轻轻震荡混匀,立即转移到酶标仪上,在450nm下读取吸光度值。
十、注意事项
(一)样本收集注意事项
1、样本收集完毕后,要分装保存在-20℃(少于3个月)或-80℃(少于6个月)以保持蛋白活性,避免污染和反复冻融。如果要在24小时内分析样本,可以保存在2-8℃。
2、采集样本后如果短期内不使用,请将样本分装后冷冻保存,避免反复冻融。冷冻样本使用前请保证充分化冻,使用前用移液器或者Vortex混匀,可离心除去絮状不溶物。
3、若母液(标准品,检测抗体及酶液)出现浑浊,轻轻振荡或吹打即可。
4、建议所有标准品及样本都设置复孔。向微孔中加入试剂或样本后,请轻轻震荡使液体混匀,并尽量保证不要有气泡。
5、高脂血或溶血的样本含有丰富的过氧化物酶,对ELISA有干扰,导致检测结果非特异性升高,不建议使用。
(二)实验操作注意事项
1、请不要将本试剂盒的试剂与其他试剂盒试剂交叉使用。
2、实验操作使用一次性吸头,避免交叉污染。
3、加样:加样时要控制时间和速度,一般加样时间控制在10分钟内。如果样本数量过多,可使用多道移液器。
4、洗涤:洗涤时微孔中残留的洗涤液应在吸水纸上充分拍干,并要消除板底残留的液体和手指痕迹,避免影响最后的酶标仪读数。
5、由于底物TMB溶液是光感性的试剂,使用前请勿长时间暴露于可见光下。同时要避免TMB与金属接触。
6、反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,10分钟左右),如果颜色较深,请提前加入终止液终止反应。
7、本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液,其具有轻微腐蚀性,使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。
8、标准曲线的R²≥0.95。
9、拍板示意图:
十一、数据处理
1) 对样本及标准品各自对应的复孔OD值取平均值。减去空白孔(即S8)OD值后带入标曲。
2) 以标准品的OD作为Y值,标准品的浓度作为X值,推荐选择四参数logistic (4-PL) 曲线拟合。
3) 将样本OD代入到标准曲线方程中计算样本中待检IgG的浓度。
4) 以下曲线仅供参考
附件一、标准曲线实例
十二、质量控制
1) 批内差CV%: 2.7-3.14
2) 批间差CV%: 8.4-9.6
3) 回收率%: 88.77-113.22
4) 线性:
稀释倍数 | Range % | Average Linearity % |
1 | 97.43-98.31 | 97.87 |
1:2 | 103.01-103.30 | 103.15 |
1:4 | 97.23-102.06 | 99.65 |
1:8 | 89.02-101.74 | 95.38 |
1:16 | 99.86-114.11 | 106.98 |
1:32 | 101.25-105.87 | 103.56 |
1:64 | 80.07-96.14 | 88.11 |
5) 灵敏度: 10.2 pg/ml
6) 特异性/交叉反应性:
Sample | Cross reactivity(%) |
Mouse IgG | 0.349 |
Bovine IgG | --- |
VERO HCP | --- |
293 HCP | --- |
MDCK HCP | --- |
OVA | --- |
chicken anti-SPA | --- |
TRF | --- |
本试剂盒是一个三步法的夹心ELISA试剂盒,样本在高含量IgG的情况下会受到钩状效应的影响。请用试剂盒稀释液稀释样本,使其IgG浓度在本试剂盒的检测范围以内。
样本稀释倍数 | OD值 |
1 | 1.105 |
10 | 2.583 |
1000 | 3.596 |
100000 | 3.701 |
10000000 | 2.317 |
100000000 | 1.495 |
1000000000 | 0.301 |
8) 局限性
本试剂盒不适用于含有叠氮化钠(NaN3)的样本,因为叠氮化钠是HRP的强抑制剂,会降低检测到目的蛋白的浓度。
十三、安全注意事项
1) 本试剂盒显色底物TMB 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine (TMB),有一定的致病风险。如果接触到TMB,请用大量的水冲洗。
应用:定量检测人血清、血浆、细胞液、体液以及组织匀浆中人IgG的含量
用途:本试剂盒仅供科研使用,不得用于临床及诊断使用!
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