你是否对提取某个原代细胞很感兴趣，但是苦于没有丰富的经验和方法？

今天我们就以“猪胰腺导管上皮细胞”为例，把从提取组织开始到培养成功的每一步都讲清楚，包括在提取的过程中遇到的问题：

消化多久？

胶原酶浓度多少？

差速贴壁到底贴多久？

这些问题却往往是原代细胞分离成败的关键。

做原代细胞，最怕的不是技术难，是明明按 protocol 一步步来，细胞还是挂了。

太多科研朋友，做原代细胞分离培养，污染、纯度不够、细胞不贴壁、存活率低，一个坑踩完再踩下一个，三个月下来换了四批样本，实验进度原地踏步。

如果你正在进行糖尿病研究、胰岛移植或再生医学相关的课题，恭喜你——猪胰腺导管上皮细胞很可能是你绕不开的核心实验材料。

说真的，原代细胞分离培养的失败率，远比你想象中高。尤其是胰腺这种含多种消化酶的器官，胰蛋白酶原一旦离体激活，细胞自溶速度超乎你想象。

做原代细胞培养的实验 er 都知道，这活儿堪称科研界的"玄学"，原代培养的成败，70% 取决于前期准备，细节决定成败。——同样一套protocol，有人能养出漂亮的鹅卵石状上皮细胞，有人却只能收获一盘"杂质"。

失败的原因，总结起来就三个方面：

翻车 1 ：污染 你的细胞是被"自己"坑死的

胰腺组织在取材的过程中容易被污染，尤其是肠道来源的细菌，胰腺与肠道接触，肠道菌群趁虚而入，即使你在宰杀现场已经处理得很小心，组织内部依然可能残留微生物。更可怕的是，支原体污染往往悄无声息——不养到第二代根本发现不了，等发现时你的细胞已经"全军覆没"。

翻车 2 ：纯度 成纤维细胞含量高达 30%-50%

上皮细胞和成纤维细胞之争胰腺组织里可不只有导管上皮细胞，还有大量的成纤维细胞、胰岛细胞、内皮细胞等"路人甲"。成纤维细胞生长速度快、生命力顽强，就像实验室里的"卷王"——你不管它，它能把你想要的上皮细胞挤到角落里去。

翻车 3 ：存活率 消化时间的把控

胰腺细胞娇气得很，消化过度会损伤细胞膜，消化不够又吹不下来，组织块难以分散，产量低；消化过度，细胞膜受损，存活率骤降。很多新手就是卡在这个环节反复"翻车"。  

而且胰腺里本身含有大量胰蛋白酶原（Trypsinogen），离体后一旦激活，会疯狂自我消化，这就是为什么胰腺组织离体后必须争分夺秒处理。

今天，iCell 赛百慷带大家拆解猪胰腺导管上皮细胞分离培养的全流程，从取材到鉴定的操作细节，再到避坑技巧，一文掌握核心技术！

一、为什么偏偏要选猪胰腺导管上皮细胞？

a. 应用价值：糖尿病研究的"明星模型"

猪胰腺导管上皮细胞，听起来冷门，但它在再生医学研究中的地位可不低：

b. 糖尿病研究：胰岛 β 细胞替代疗法的关键细胞来源

c. 胰岛移植：猪胰岛是异种移植的热门候选

d. 药物筛选：胰腺疾病药物研发的重要体外模型

二、为什么选猪不选鼠？

猪胰腺的解剖结构和生理功能，与人类高度相似。猪胰腺导管上皮细胞因与人类胰腺生理结构高度相似、增殖能力强、易培养等优势，成为科研界的“明星细胞”。

新生1-2 周龄的猪仔，新生猪仔的胰腺尚未完全发育成熟，腺泡细胞比例相对较低，导管系统清晰可见。这个时期的组织再生能力强、结缔组织疏松，胶原酶消化后更容易释放出完整的导管片段，胰腺虽小但导管结构完整，非常适合做原代分离培养。

三、分离培养全流程：高效获取高活性细胞

猪胰腺导管上皮细胞为贴壁生长型细胞，形态呈铺路石状，增殖能力强，但分离时易混杂成纤维细胞、腺泡细胞，需严格遵循 “快速、无菌、温和” 三大原则。

步骤 1：取材 — 新鲜组织，活性保障

选取新生 1-2 周龄健康猪仔，无菌宰杀后快速取出胰腺（胰腺富含消化酶（胰蛋白酶原、胰脂肪酶等，离体后自溶速度极快），立即放入无菌的加了1%-3%双抗的过冷PBS容器中（加了双抗的话可以更加有效的避免污染），30 分钟内转移至实验室（胰腺组织离开机体后，细胞活性会迅速下降。理想情况下，从宰杀到实验室处理不要超过 30 分钟），避免组织缺氧坏死。

步骤 2：清洗 — 去除杂质，减少污染

生物安全柜内，将胰腺转移至无菌培养皿，用预冷无菌 PBS 反复冲洗 3-5 次，彻底去除血液、脂肪及表面杂质，降低后续污染概率。

这一步越干净，消化后碎片越少，成纤维细胞污染的概率越低。随后反复漂洗至液体清亮无血迹。

步骤 3：修块 — 精细剥离，纯化组织

用无菌精细镊子与眼科剪，仔细剔除胰腺脂肪、被膜及血管组织（杂质易抑制细胞生长、增加杂细胞污染），仅保留淡粉色、质地均匀的胰腺实质组织。

步骤 4：剪碎 — 适度破碎，助力消化

将纯化后的胰腺组织转移至新培养皿，用无菌剪刀剪碎至1-2mm³ 细小组织块（米粒大小），避免过碎导致细胞机械损伤，过大会延长消化时间，PBS 清洗 2-3 遍，去除组织碎屑。

步骤 5：消化 — 精准酶解，释放细胞

加入 0.1%（浓度太低消化不充分，细胞得率低；浓度太高会损伤细胞膜表面蛋白，影响后续贴壁。）胶原酶 Ⅴ 溶液，浸没组织块，置于37℃电热恒温震荡水槽，震荡消化 30-40min（每 5 分钟轻轻摇晃 1 次，促进酶解）。

关键判断：组织块变松散、呈絮状，即可停止消化，避免过度消化损伤细胞膜。

步骤 6. 过滤— 去粗取精

取出消化物，用宽口吸管轻轻吹打3-5次，帮助导管片段脱落。然后静置10分钟，让未消化完全的大组织块自然沉降。小心吸取中上层悬液，过100μm筛网，去除残留大颗粒。

步骤 7：离心 — 浓缩细胞，去除酶液

将滤液转移至无菌离心管，300g 低速离心 5min（转速过高易导致细胞挤压损伤），弃上清，保留细胞沉淀。这团沉淀里，就藏着我们的主角——导管上皮细胞团。

步骤 8：重悬接种 — 完全培养基，助力贴壁

用预热的iCell 定制完全培养基（含 10% 胎牛血清、上皮细胞生长因子、双抗）轻柔重悬细胞沉淀，接种至 T25 细胞培养瓶，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱静置培养。

步骤 9：差速贴壁 — 纯化细胞，去除杂细胞

接种 1h 后，成纤维细胞优先贴壁，导管上皮细胞仍悬浮。此时收集未贴壁细胞悬液，300g 离心 5min，用新鲜完全培养基重悬，接种至新 T25 培养瓶，继续培养箱静置培养。

核心优势：差速贴壁法可高效去除成纤维细胞，提升导管上皮细胞纯度至 90% 以上。

步骤 10：换液传代 — 隔天半换，维持培养

培养第二天观察细胞贴壁情况（显微镜下可见细胞呈铺路石状、逐渐伸展），隔天半量换液（弃半旧培养基，加半新鲜完全培养基），帮助上皮岛迅速扩增。待上皮岛连成一片、密度达70-80%时，即刻传代，过密会导致接触抑制和细胞衰老，过稀则细胞增殖困难。

四、常见问题避坑指南：解决痛点，提高成功率

❌ 问题 1：细胞污染（细菌 / 真菌）

原因：无菌操作不规范、试剂污染、环境不洁

解决：严格无菌操作（紫外消毒 30min + 酒精擦拭）；培养基加双抗（青霉素 100U/mL + 链霉素 100μg/mL）；定期检测支原体。

❌ 问题 2：细胞得率太低

原因：胶原酶活性不足（过期或保存不当）、消化时间不够、组织修剪时去除了太多实质部分；

解决：胶原酶V需-20℃保存，工作液现配现用；适当延长消化时间（但不超过50分钟）；修剪时"只去非实质组织"，保留导管周围的实质部分。

❌ 问题 3：成纤维细胞污染严重、纯度低

原因：组织去膜不彻底、差速贴壁时间不当、培养基不适配

解决：严格剔除脂肪血管组织；接种 1h 后差时贴壁纯化；如果差速后仍有污染，可重复差速贴壁1-2次,传代时利用胰酶消化时间差（成纤维细胞先被消化脱壁）进一步纯化；使用专用的上皮细胞完全培养基，抑制成纤维细胞生长。

❌ 问题 4：细胞贴壁困难、漂浮死亡

原因：消化过度损伤细胞膜、血清浓度低、培养基不适合上皮细胞生长、接种密度过低

解决：控制消化时间；使用 iCell 上皮细胞专用培养基；调整消化时间；如果细胞活力尚可，可适当提高接种密度。

四、细胞鉴定：怎么确认你养的是"正版"导管上皮细胞？

1. 形态学鉴定 上皮细胞的"长相"

倒置显微镜下观察，合格的猪胰腺导管上皮细胞应呈"鹅卵石状"或"铺路石状"排列细胞边界清晰，多角形，紧密排列形成单层。这是上皮细胞的典型形态特征。

如果看到大量梭形细胞：那大概率是成纤维细胞污染，需要加强差速贴壁步骤，或者考虑化学法抑制成纤维细胞生长。

2. 免疫荧光鉴定 分子层面的"身份证"

用免疫荧光法检测以下标志物（至少 2 种阳性即为合格）： CK19（细胞角蛋白 19）：导管上皮细胞的特异性标志物，几乎所有导管上皮细胞都表达。

PDX1：胰腺发育及胰腺导管上皮、腺泡、胰岛细胞维持的关键转录因子。

E-cadherin：介导上皮细胞间黏附，是上皮细胞表型的核心标志物。

CA19-9：胰腺导管上皮特征性分泌蛋白，胰腺癌经典标志物。

iCell 提供 STR 鉴定、支原体阴性检测、多标志物免疫荧光鉴定服务，帮您从分子层面确认细胞身份。

看完整个流程，你可能会觉得：步骤多、耗时长、对技术熟练度要求高。原代细胞分离培养这件事，从取材到鉴定，每一步都有坑，不是每个实验室都有条件、有时间去踩完这些坑。

如果你觉得原代分离培养太麻烦，或者实验进度不允许你慢慢摸索——iCell 可以提供现成的高质量猪胰腺导管上皮细胞，省去你自己分离培养的烦恼。

iCell的产品优势：

• STR 鉴定齐全、支原体阴性——确保细胞身份无误，杜绝污染风险

• 来源可追溯、GMP 质控——批间差小，实验结果更稳定

• 稳定货期、高性价比——不用担心"断货"，预算可控

• 配套专用培养基和支原体清除剂— 一站式采购，省心省力

五、iCell 赛百慷专属服务：助力科研，省心高效

猪胰腺导管上皮细胞原代培养技术门槛高、耗时久，新手易失败。iCell 赛百慷深耕原代细胞领域多年，提供一站式解决方案：

✅ 优质原代细胞：现货供应猪胰腺导管上皮细胞，纯度＞90%、活性＞95%、无支原体 / 细菌污染，直接复苏即可实验，省去分离繁琐步骤。

✅ 定制化培养基：专用胰腺导管上皮细胞完全培养基，含适配生长因子，无需自行配制，开箱即用，显著提升细胞存活率与增殖能力。

✅ 专业技术服务：提供细胞培养技术外包、实验方案设计、疑难问题解答，资深技术团队全程跟进，助力科研高效推进。

✅ 试剂耗材供应：全系细胞培养试剂、耗材（胶原酶、胰蛋白酶、培养瓶等），品质保障，性价比高，一站式采购更省心。

做原代细胞这条路，坑多且深，但走过来的人都变得更厉害了，我们不只是卖细胞的——我们更希望能帮你解决实验中的实际问题，关于细胞培养、实验方案设计的任何问题，欢迎私信或留言咨询。