细胞描述

小鼠胚胎干细胞。该细胞缺乏 HGPRT（HPRT），并且对 0.06 mM 的 6-硫鸟嘌呤有抗性。当在饲养层（胚胎成纤维细胞或 STO 细胞）上培养时，细胞保持未分化状态。在没有饲养层的情况下，细胞自发分化并形成胚胎结构。当注入胚泡中时，细胞可以进入生殖系。在常规的分子基因修饰技术之后，它们可用于重构小鼠胚胎。培养时需使用昆明白MEF作为饲养层细胞。

细胞特性

1） 来源：小鼠，129/Ola品系，胚胎内细胞团

2） 形态：球形克隆 贴壁生长

3） 含量：>1x10^6  细胞数

4） 规格：1mL冻存管包装

5） 用途：仅供科研使用

运输和保存

干冰运输：1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

一．培养基及培养冻存条件准备

1）准备DMEM 基础培养基 (iCell-0001)                81.5%      

      优质胎牛血清 （iCell-0500）                            15 %

      GlutaMAX-1谷氨酰胺  ( iCell-0900)                  1 %

      MEM NEAA非必需氨基酸 (iCell-01000)          1%

       P/S青霉素-链霉素 （iCell-15140-122）           1%

      β-巯基乙醇  (iCell-8211)                                      1.25 mL

       LIF  (iCell-50756)                                                10ng/mL

注意：

1、建议使用KM- MEF作为饲养层细胞。

2、在铺胚胎干细胞前，需对MEF进行处理，具体处理步骤见下文丝裂霉素灭活MEF。

3、该细胞建议冻存干冰发货，不适合长时间活细胞运输，会影响细胞活力。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：完全培养液 60%%，FBS 30%%，DMSO 10%%现用现配。

我库冻存时，体积为 500 μl，预期存活率 70%，每支冻存管的细胞复苏，3 至4 天后，会形成 30 至 40 个克隆，建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中。

二：细胞处理

丝裂霉素灭活MEF

待MEF细胞密度达到80%以上，加入含丝裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培养液，置于37培养箱中孵育2.5h，2.5h后，弃掉培养液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培养基，备用，当天2h后或者第二天可以传入小鼠胚胎干细胞。

复苏：

1.将小鼠胚胎干细胞冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液的 15ml 离心管内，以 1000 rpm，离心 5 min。

3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液 2 ml，吹打悬浮。

4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。

5.  转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养。

6. 每天更换小鼠胚胎干细胞完全培养液。

传代：

1. 一般在复苏后第 2-3 天传代，视克隆大小和密度而定

2. 吸除废液。

3. 用 PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于 37℃培养箱内消化细胞。

5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液终止消化。

7.  以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清。

8. 加入约 1 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞， 制成单细胞悬液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中。一般地，一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液。放入 37℃培养箱内培养。每天换液。

传代比例：1:4-1:7

冻存：

1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。

2.  以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。

3. 按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。

4．将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：

小鼠胚胎干细胞完全培养液 60%，ES 级 FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：

1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞， 吹打混匀，细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25 培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞）中。

2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时。

3.  1 小时后，绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。收取培养液，进行后续实验。