细胞介绍

PY8119 是一种间充质样细胞系，于 2004 年从患有腺癌的成年雌性小鼠的乳腺中分离出来。该细胞系是研究恶性乳腺肿瘤发生和转移的多步进展的模型，也可用作三阴性乳腺癌的临床前小鼠模型。PY8119细胞系代表源自MMTV-PyMY（小鼠乳腺肿瘤病毒启动子驱动的多瘤中T抗原）转基因C57BL/6雌性小鼠中自发产生的乳腺腺癌的间充质肿瘤细胞。该细胞系携带多瘤病毒中T癌基因，但其表达下调。Py8119 细胞在某种程度上呈纺锤形，在培养中不会形成离散的集落。该细胞系非常强大，可在体内形成侵袭性间质肿瘤。原位注射时肿瘤不会转移，但尾静脉注射会导致多个部位出现肿瘤，包括肺、肝和骨。Py8119 表达间充质标记物 N-钙粘蛋白、波形蛋白、Slug (SNAI2) 和细胞角蛋白 14，并且雌激素受体、孕激素受体和 HER2（人表皮生长因子受体 2）的表达呈阴性。与同样源自 MMTV-PyMY 转基因 C57BL/6 雌性小鼠 (PubMed) 的分化程度更高、上皮样 CRL-3279、Py230 细胞相比，Py8119 细胞系表现出更未分化的表型，并且在细胞培养物中生长更积极。Py8119 细胞与 Py230 细胞是一对鼠乳腺细胞系，具有独特的间质 (Py8119) 或上皮样 (Py230) 特征，源自 C57BL/6 小鼠中 MMTV-PyMT 转基因诱导的乳腺肿瘤，可用于研究乳腺肿瘤发生。

该细胞通过慢病毒转染的方式携带GFP基因。

细胞特性

1） 来源：小鼠

2） 形态：间质细胞样，贴壁生长

3） 含量：>1x106  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5）用途：仅供科研使用。

细胞筛选

该细胞为构建好稳定转染GFP的细胞，随细胞传代次数的增加，其GFP荧光强度会逐渐减弱。若实验要求需要维持荧光强度，可以加入嘌呤霉素进行再次筛选。建议收到细胞后至少传3代，冻存留种后再进行筛选。

初次进行细胞筛选时，建议加入终浓度为1ug/ml嘌呤霉素的完全培养基维持培养，若无细胞漂浮或者漂浮较少，即可更换为含2ug/ml嘌呤霉素的完全培养基继续筛选，以此类推，至最高药物浓度为5ug/ml。若筛选过程中，漂浮细胞大于60%，则停止筛选，换成正常培养基培养，至细胞密度约80%，可继续加入同浓度嘌呤霉素进行筛选。当加入5ug/ml嘌呤霉素时细胞正常增殖，可停止筛选，用不含药完全培养基正常培养。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

一．培养基及培养冻存条件准备

1） 准备F12K（推荐iCell-0007）培养基；优质胎牛血清，5%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理

1） 冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。 

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。