储存条件：   -80°C

保存期限：   2年

实验流程

用构建的慢病毒载体和包装质粒（packaging mix）共转染慢病毒包装细胞，包被病毒，收集 病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度。

抽提高纯度、无内毒素的干扰慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒，使用

transgene reagent 将 构建好的干扰慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进慢病毒包装细胞，转染 12h 后加 Enhancing buffer，接着 4h 后更换新鲜培养基，继续培养 48h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液， 对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。

实验材料

1.细胞株 :慢病毒的包装细胞：贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培 养生长增殖形成单层细胞。

2. 菌株 :大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

3. 慢病毒包装系统 :将构建成功的慢病毒重组质粒和包装质粒采用 Qiagen 公司的质粒抽提试剂盒提取。所得的质 粒 DNA 溶于无菌的 TE 中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒 DNA 的 A260/A280 在1.8～2.0 之间。

4.实验试剂和仪器：  台盼兰 胎牛血清 DMSO DMEM 胰酶 Polyethylenimine, liner, MW-25000（cat#23966）荧光显微镜 CO₂ 培养箱 生物安全柜 离心超滤装置

实验方法

1.细胞分盘.转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到80%~90% 时准备转染.

2.转染前换液：转染前1~2 h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，10mL/10cm皿。

3.转染：取无菌的1.5mL EP管，转染体系按下表:

混匀后，室温放置15 min - 20 min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO₂培养箱中培养

4. 加 Enhancing buffer转染12h后，均匀滴加100xEnhancing buffer促进转染。

5.换液：转染18~20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15mL新鲜的细 胞培养基（含2%血清的DMEM ）继续培养。

6. 病毒收集：换液48h后，吸取细胞上清液于50mL离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.45pm滤 器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到centrifugal filter devices中，4℃ , 4500g ,离心10min ,弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中,最后一次4℃ , 4500g ,离心20min ,此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。

7.病毒收集分装与保存：将病毒以50p L分装，保存于-80℃，干冰运输。

滴度测定（药筛法测病毒滴度）

1.将HEK 293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含10%FBS的细胞培养基。

2.第一天,HEK293T细胞胰酶消化计数，按照每孔1E5细胞接种24孔板中，每孔1ml培养液，37度 培养过夜，感染时细胞长至30%左右的融合密度；

3.第二天：将待测慢病毒提前于-80度冰箱中拿出冰浴融化，病毒稀释，设定病毒滴度：1E+8TU/mL,2E+8TU/mL, 5E+8TU/mL, 8E + 8TU/mL, 1E+9TU/mL , 5 个滴度梯度，对应病毒稀释液如下：

1号稀释液:10pL病毒液+490pLDMEM完全培养基

2号稀释液:5pL病毒液+495pLDMEM完全培养基

3号稀释液:2pL病毒液+500pLDMEM完全培养基

4号稀释液:1.25pL病毒液+500pLDMEM完全培养基

5号稀释液:1pL病毒液+500pLDMEM完全培养基

4.轻轻混匀各管慢病毒稀释液，选取所需的细胞孔，吸去培养液，将稀释混匀病毒加入每孔细胞中，此 时每孔培养液总体积500ul，放入37度的细胞培养箱中过夜培养；

5.第三天：去除含慢病毒的培养液，加入500 |JL的完全培养基;

6.第四天只带PURO抗性病毒），每孔加入2ug/ml puromycin。对应每孔体积加入1mg/ml puromycin 2ul ；加入一个无病毒组孔做阴性对照 。注：带荧光和Puromycin双重筛选标志可以选择不加puromycin

7.第五天：慢病毒感染72小时，在荧光显微镜下观察各孔中各孔细胞死亡比例。病毒滴度为对应滴度孔 的滴度乘以对应各孔中各孔细胞死亡比例，即滴度（TU/mL）=各孔细胞死亡比例*对应孔的标准。若3号 孔中病毒感染效率未达到100%，则按照此孔感染效率计算滴度。若3号孔病毒感染效率已达到100%， 则按照4号孔感染效率计算滴度。

8.第六天（可选）:puromycin加压孔继续观察

数据分析

慢病毒原液滴度测定：慢病毒感染细胞后72小时部分孔（某一视野）的照片如下： 对令

1号孔：1号稀释液，对应滴度1E+8TU/mL

2号孔：2号稀释液，对应滴度2E+8TU/mL、

3号孔：3号稀释液，对应滴度5E+8TU/mL

4号孔：4号稀释液，对应滴度8E+8TU/mL

5号孔：5号稀释液，对应滴度1E+9TU/mL

SV40 部分孔滴度照片

                                      第一个孔

                                    第二个孔

计算方式：在荧光显微镜下观察结果， 第 二 个孔感染效率为 100% ， 即 滴 度 =100% 2E+8TU/mL=2.00E+8TU/mL。