支原体污染 PCR 检测试剂盒，用于检测细胞培养中的支原体污染，也可作为支原体通用检测试剂盒 使用，可检测属于柔膜菌纲(Mollicutes)的支原体（Mycoplasma）、脲原体（Ureaplasma）、无胆甾原体 （Acholeplasma）、螺原体（Spiroplasma）、虫原体（Entomoplasma）、中间原体（Mesoplasma）等超过一 百种，但不适用于检测嗜血支原体，与柔膜菌纲以外的其他生物没有特异性反应。

        支原体，也有称为霉形体、霉浆菌或微浆菌，是一种直径约为 0.1-0.3 μm、无细胞壁的原核生物，属 于柔膜菌纲(Mollicutes)，常被用作柔膜菌纲的统称。具有变形能力，可透过常见过滤膜（0.22-0.45 μm）， 因此常规的无菌过滤方法不能将其去除，靶向细胞壁的抗生素也对支原体无效。支原体污染是基础研究 和工业生产中一个很常见的问题，不同实验室污染情况不尽相同，在一些不重视的实验室，可能有高达 90%以上的细胞受到支原体污染。支原体在光学显微镜下不可见，对培养基的需求有限，一般不会引起培 养物混浊，因此细胞被支原体污染一般难以察觉。支原体污染能消耗营养物，促进代谢积累，导致 pH 改 变，诱导或抑制细胞因子表达，并改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态。由于支原体污染能影响几乎 每一个细胞参数，所以很多研究都强调常规检测正在培养的细胞，以确保观察到的结果不被支原体污染 所损害。支原体种类繁多，目前已知的污染细胞的支原体有 20 多种，一般是由试剂和人工操作带入，95% 的污染事件是由常见的五种支原体引起；由原代细胞的原始组织带入也可形成污染，此类污染的支原体 种类分布较为广泛。

本试剂盒具有以下特点：

①特异性引物是针对高度保守的支原体 16S rRNA 序列设计的，可用于检测 非常广泛的支原体种类，不受真核细胞或细菌 DNA 干扰。经本试剂盒测试的支原体菌株涵盖了所有常见 的支原体污染种类；

②灵敏度极高，最低仅需 10 个拷贝的支原体基因组即可使检测呈阳性；

③含阳性对 照，可帮助判断假阴性现象；

④只需进行一次 PCR 反应，使用方便。

试剂盒组份

组份                                        成份                                                          体积（微升）

                                                                                         MD01-20             MD01-50              MD01-100

组份 A（蓝盖管）     Taq 酶，dNTPs，染料                   250                       625                       1250

组份 B（绿盖管）             上下游引物                              50                        125                        250

组份 C（黄盖管）            阳性对照样品                           50                         125                        250

水（白盖管）                 无 DNA 酶超纯水                       200                        500                      1000

保存条件：保存于-20℃ , 避免反复冻融。没有反复冻融的情况下，保质期一年。

操作步骤：

1、样品准备： 取 1 毫升细胞培养上清（贴壁和悬浮细胞都可以,最好已培养 48 小时以上），在 16000g 离心 5 分钟，小心弃去上清，避免丢失沉淀（沉淀量有可能很少，目视看不到）。将沉淀用无菌 PBS 重悬， 在 16000g 离心 5 分钟，同样小心弃去上清，如此反复用无菌 PBS 洗三次。最后将获得的沉淀用 100 微升 超纯水重悬，置于 100℃水浴中孵育5 分钟，如此获得的 DNA 可在 4 度保存 1 到 2 个月。对于组成成份 较复杂的组织样本或拭子，建议使用 DNA 抽提试剂盒提取 DNA。

2 、PCR 反应的准备：

待试剂盒各组份在室温融化后先瞬时离心，然后轻弹混匀。按下表在已灭菌的 PCR 管中配制反应体

系，每次实验均需加一个阴性和一个阳性对照，测试反应管可以有多个。配制过程中应注意无菌，戴口 罩，并注意避免操作产生的气溶胶造成样品间的交叉污染，推荐在有风压的设备如超净台或生物安全柜 中进行操作。配制完毕后瞬时离心以使液体沉至管底。

本试剂盒非常灵敏，操作时产生的微量气溶胶即可造成样品之间的相互污染，因此须小心谨慎，避 免剧烈操作。加液时枪头最好贴着管壁，所有管子用完即盖，对照样品和待测样品留在最后一步加入，取过样品的枪头用完即弃，尽量减少操作时污染的可能性。

体积（微升）                           阴性对照管                    阳性对照管                          测试反应管*

组份 A                                            12.5                               12.5                                      12.5

组份 B                                             2.5                                 2.5                                         2.5

组份 C                                              -                                   2.5                                         2.5 / - *

水                                                    10                                  7.5                                         5.5 / 8 *

待测样品                                         -                                    -                                            2

总体积                                            25                                  25                                          25

*组份C 可以提供一个排除假阴 性的方法：在不确定待测样品是否 含有PCR 抑制物的情况下，可单独 设置一管，将一个或多个待测样品 与组份C 共同反应，若无条带出现， 则可判断为PCR 反应受到了抑制， 即存在PCR 抑制物，可能产生假阴 性结果。

3 、PCR 反应

降落 PCR 法（Touchdown PCR）：94℃变性 2 分钟；首循环：94℃变性 30 秒，68℃退火 30 秒，72℃ 延伸 45 秒；从第二到八个循环开始，每循环退火温度下降 1℃, 其余不变；从第九个循环开始，反应条 件固定为：94℃变性 30 秒，60℃退火 30 秒，72℃延伸 45 秒，循环 32 次；循环结束后，在 72℃延伸 7 分钟，最后保持在 4℃。

4、琼脂糖凝胶电泳：

按常规方法准备好 2%琼脂糖凝胶，加入 EB 或 Gold-View 等用于显色。每份反应液取 8 微升，无须 加入上样缓冲液，直接加入凝胶加样孔中，另留一孔加入 DNA marker（最好在 400-700bp 区间有显示条 带），120 伏电泳约 30 分钟。在紫外线下观察电泳结果，阳性对照（组份 C）应在 643bp 处有一条带，阴 性对照无条带，支原体阳性条带在 438-470bp 区间。