肝细胞癌（HCC）是全球最常见的癌症之一，其过继性免疫疗法值得研究。CD133是一种癌症干细胞（CSC）抗原，与glypican-3（GPC3）一起已被证明在HCC细胞中高度表达，并且它们可作为作产生嵌合抗原受体（CAR）T细胞的靶标。但在CAR T细胞治疗中存在“脱靶”毒性，存在低转染疗效和抗肿瘤能力弱等局限性。

       来自中国复旦大学附属中山医院的一个研究团队针对一种非病毒mcDNA介导的双特异性CAR T细胞进行了研究，旨在研究其抑制肿瘤增殖能力。

      研究从健康供体获得外周血，通过密度梯度离心分离T细胞。研究人员使用电穿孔系统将抗CD133和抗GPC3单链片段变量（scFv）结构作为靶基因递送到T细胞中。细胞膜由瞬时电流效应打开，靶基因通过非病毒微圆DNA（mcDNA）载体递送到细胞中。
       采用流式细胞术和蛋白质印迹法检测两种scFv是否同时转染以及该双特异性CAR-T细胞生成方法的转染功效。再通过CCK-8测定和HCC异种移植小鼠模型分别检测了CAR T细胞的体外和体内肿瘤抑制功效。同时含有CD133和GPC3抗原识别位点的CoG133-CAR T细胞是效应细胞。CD133-CAR T细胞和GPC3-CAR T细胞定义为单靶向对照组，正常T和模拟T细胞定义为空白对照组。
       mcDNA载体适应两个成功转染的靶基因结构以产生双特异性CAR T细胞。基因水平和蛋白质水平的检测方法证实，CoG133-CAR T细胞具有较强的转染效率，并表现出CD133和GPC3的抗原结合能力。与单靶点CAR T细胞或对照T细胞相比，CoG133-CAR T细胞在体外对CD133和GPC3双阳性HCC细胞系和体内HCC异种移植小鼠具有增强的消除功效。苏木精和曙红（H&E）染色表明CoG133-CAR T细胞和主要器官上不存在致命的“脱靶”组合。
       该研究表明，通过非病毒mcDNA载体制备双特异性CAR T细胞具有更高的效率和安全性。CoG133-CAR T细胞通过双重抗原识别和内部激活增强肿瘤抑制能力。它为肝细胞癌（甚至是实体瘤）的CAR-T治疗提供了一种创新策略。