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赛百慷新型脐带间充质干细胞培养方法——胶原酶消化法
作者:赛百慷    日期:2017-06-15


       随着科研成果的不断探索,间充质干细胞的研究和应用也越来越受到关注,干细胞在医学界的应用也越来越广,尤其是婴儿的脐带间充质干细胞由于其重要作用,不仅在疾病治疗方面起着重要作用,而且在美容行业和健康方面也越来越备受关注。

       脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,具有高度分化潜能,基因稳定、不易突变,不会引起肿瘤;无需配型、无排异,广泛应用于疾病治疗及抗衰老研究。

       脐带间充质干细胞能分化成许多种组织细胞包括骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织,具有广阔的临床应用前景。目前,在美容行业及针对亚健康群体的应用,也越来越引人注目。



       脐带是由包膜、华通氏胶、脐静脉、脐动脉脐构成。脐带间充质干细胞存在于华通氏胶中。由于存在数量少,用胶原酶消化后获取的细胞量很少。另外,一般的胶原酶消化法获取细胞时,胶原酶对细胞的伤害较大,培养出来的细胞状态差。
       贴块方法培养人脐带间充质细胞是普遍采用的方法,但是,细胞从组织中爬出来的时间长(10-20天,甚至更长)。那么怎样才能获取状态更好的脐带间充质干细胞呢?
       为了更好的获取细胞量,赛百慷的技术人员经过不断的摸索和研究,终于找出一个用胶原酶消化获取脐带间充质干细胞的方法,具体操作如下:
       ① 在剪断连接婴儿端和母亲的脐带后,立刻用脐带夹夹住,防止内部污染。装入无菌袋(容器)中,送进实验室。
       ② 在生物安全柜或超净工作台内,取出脐带,连同脐带夹用75%的酒精泡2min(50ml离心管或250px皿)。如果脐带较长,无法装入容器,可以把脐带剪成250px左右,但是剪断之前一定要用脐带夹加好,防止酒精进入脐带内部,损伤细胞。
       ③ 用酒精处理完,迅速移入装有PBS或生理盐水的容器中浸泡清洗2次,每次2min即可。
       ④ 剪掉脐带夹,把脐带剪成2-75px段,用剪刀从脐静脉内侧剖开脐带,用带齿镊子(脐带组织比较滑,用带齿镊子好操作)把脐静脉、脐动脉以及脐带包膜去除,防止杂细胞混入。
       ⑤ 用剪刀剪碎脐带组织,0.1%Ⅱ型胶原酶(稀释液用DMEM/F12)过夜消化,4℃过夜消化。

       ⑥ 第二天,把未消化完的组织倒到100目(80目、160目都可以)的钢制筛网上(最好是钢制网筛,承载的组织量大,便于操作),用PBS(或生理盐水)多次冲洗,尽可能去掉附着在组织表面上的胶原酶。最后用完全培养基冲洗1-2次,去除PBS(或生理盐水)。


       ⑦ 倒入皿中(放入瓶中操作不方便),在未消化组织块上加入少量培养基培养(6ml加2-3ml、10ml加3-4ml)(其目的是减少残存胶原酶对细胞的伤害)。次日,组织块完全消失(被浸入到组织中的胶原酶消化掉了),细胞完全被分散开,显微镜下可以看到已经消化完的组织中有许多被分散的细胞。再加入少量培养基(150px加2-3ml、250px加4-5ml)加入培养基后继续培养。
       ⑧ 两天后继续添加少量培养基(150px加2-3ml、250px加4-5ml)培养。
       ⑨ 一两天后,细胞数量会有明显增加(许多成集落生长),分别移入两个50ml离心管中,加入PBS(或生理盐水)至50ml,混匀,2500rpm、6min离心。
       ⑩ 用5-6ml(根据细胞量)完全培养基重悬,1000rpm、6min离心,铺到T25瓶中,加入5ml完全培养基培养。
       ⑪ 三天后,可以换液或添加3-4ml完全培养基继续培养。之后每三天换液,直至长满(70%以上即可传代)
       启示与注意事项:
       ① 此方法具有易于操作,培养时间短的特点。
       ② 用胶原酶消化脐带,37℃下,数小时以内基本能够把脐带消化完,但同时对细胞的伤害较大。胶原酶能够浸透到脐带组织内部,低浓度的胶原酶从内到外消化组织,对细胞伤害较小。(胰蛋白酶对脐带组织消化效果非常差)

       ③ 彻底消化完组织,并没有单独把细胞分离出来的原因,是脐带胶原成分(粘稠)会促使脐带间充质干细胞增殖。多数细胞悬浮在胶原当中,以集落方式增殖,这是铺到瓶中,细胞保持良好状态的主要原因。



       ④ 培养脐带间充质干细胞时,不要用带有血清的培养基(血清会促进细胞分化),而是用干细胞专用培养基。传代也尽量不用胰蛋白酶消化(胰蛋白酶对脐带间充质干细胞伤害大),应该采用专用消化液,能够保证细胞更多的传代次数。

       赛百慷经过多年的发展和自身拥有的细胞培养技术,迄今为止,已与国内外多家大学、科研院所、药企巨头、医疗美容行业等建立了良好的合作关系,为这些平台提供了大量的科研细胞和培养基。各种新型的细胞培养技术也在不断的申请国家专利,目前已经拥有多项专利技术,在生物行业领域也不断的得到社会的认可。

       这项技术的开发与应用使得赛百慷在生物行业领域内向科学技术领域又迈向一大步,同时也在技术领域内比同行业领先一步,不仅奠定了赛百慷在生物技术领域内强大的技术地位,也使赛百慷在未来生物技术行业产生重要影响。


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