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iCell人诱导多能干细胞(iPSC)培养体系
Multi - potential Stem Cells / iPS Medium

货号:iPSMed-iCELL-001

价格: 2380.0

规格: 500ml   

数量: +

产品简介

iPS细胞培养基是赛百慷(上海)生物技术股份有限公司(iCell)开发出的一种适用于无饲养层培养、化学成分明确、并且不含动物源蛋白的人多潜能干细胞(hESC/hiPSC)完全培养基。iPS细胞培养基是在James Thomson实验室开发的Essential 8培养基的基础上,由赛百慷(上海)生物技术股份有限公司改良研发出的最新型多潜能干细胞完全培养基。hESC/hiPSC在iPS细胞培养基中可以快速增殖,而分化的细胞则无法在该培养基中生长,从而选择性扩增并获得高纯度多潜能干细胞。

产品内容

名称

规格

数量

iPS细胞基础培养基

500mL

1瓶

iPS细胞添加剂

7mL

1支

储存条件

基础培养基2 ~ 8℃,添加剂-80 ~ -20℃;混匀后2 ~ 8℃,2周内使用完毕。

需要材料

•iPS细胞培养基

•iPS细胞复苏培养基

•培养皿/瓶铺底基质:iPS细胞铺底工作液

•细胞培养级无钙镁的PBS溶液

•iPS细胞消化液

•细胞培养级DMSO

培养材料准备

• iPS细胞完全培养基:室温解冻iPS添加剂,吹打混匀,随后将添加剂加入iPS细胞基础培养基形成iPS细胞完全培养基(每0.7mL添加剂与50mL基础培养基混合)。iPS细胞完全培养基可在2 ~ 8℃稳定储存2周。

注:iPS细胞添加剂需在室温解冻,可按实际用量对添加剂进行分装,分装后重新置于-80 ~ -20℃保存,避免反复冻融。

• iPS细胞解冻(复苏)完全培养基:室温解冻添加剂,吹打混匀,随后将添加剂加入基础

培养基形成 iPS 复苏完全培养基(每0.14mL添加剂与10mL基础培养基混合)。iPS复苏

完全培养基可在2 ~ 8℃稳定储存2周。

注:iPS细胞复苏培养基添加剂需在室温解冻,可按实际用量对添加剂进行分装,分装后重新置于-80 ~ -20℃保存,避免反复冻融。

• iPS细胞铺底工作液包被培养皿/瓶:往培养皿/瓶中添加工作液至完全覆盖皿/瓶底,37℃包被4小时以上备用。包被好的培养皿/瓶,如果暂时不用,可用PARAFILM封口后2 ~8℃储存,并于1周内使用,保存期间,iPS细胞铺底工作液需始终保持完全覆盖皿底。

细胞传代

当满足以下条件之一时需要进行传代

• 干细胞汇合度达到80%以上;

• 干细胞集落过大,中央细胞生长不良;

• 干细胞集落边缘有开始分化的迹象。

传代比例:

• 通常早代次(<10代)的干细胞需要以较低的比例传代,如1:2 ~ 1:6;成功建系的干细胞(10代以上)可以1:8 ~ 1:12的比例传代,传代的比例由细胞株的生长速率决定。

• 比较理想的传代时间间隔是3 ~ 6天一次。

iPS细胞消化液的传代操作:

1. 将iPS细胞完全培养基取出并平衡至室温,取出包被过iPS细胞铺底工作液的培养皿/瓶,吸去包被液并加入适量iPS细胞完全培养基,置于5% CO2的37℃恒温细胞培养箱中。

2. 吸走待传代细胞培养皿/瓶中的iPS细胞完全培养基,并且加入无钙镁的PBS溶液洗一次。

3. 加入iPS细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底。

4. 室温放置5 ~ 8分钟或37℃恒温细胞培养箱中孵育3 ~ 5分钟,显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底,克隆内部大部分细胞间出现间隙但尚未相互分离,肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白,表明细胞消化时间理想。

5. 吸去消化液,即刻加入新鲜的iPS细胞完全培养基,用移液器扇形吹打培养皿/瓶底,使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落,轻柔缓慢吹吸混匀。

注:吹吸的力度要轻柔,吹打脱落和吹吸混匀的次数总共不超过10次为宜。吹打过度导致大量单细胞出现是造成细胞分化或死亡的重要原因。

注:如有少量细胞无法从皿底脱落,属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落,需延长消化时间。

6. 显微镜下观察细胞呈4 ~ 20个细胞大小的团块,水平十字摇匀。

7. 将细胞置于5% CO 2 的37℃恒温培养箱培养。

8. 每天换液直至达到可以传代的标准。

细胞冻存:

1. 配制冻存液:90%iPS细胞完全培养基+10% DMSO,置于2 ~ 8℃备用;将iPS细胞完全培养基取出并平衡至室温。

2. 吸走待传代细胞培养皿/瓶中的iPS细胞完全培养基,并且加入无钙镁的PBS溶液洗一次。

3. 加入iPS细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底。

4. 室温放置5 ~ 8分钟或37℃恒温细胞培养箱中孵育3 ~ 5分钟,显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底,克隆内部大部分细胞间出现间隙但尚未相互分离,肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白,表明细胞消化时间理想。

5. 迅速吸去传代液,加入适量的iPS完全培养基终止消化,用移液器扇形吹打皿/板底部(吹打不用超过10次),使附着的细胞集落脱落。(如果消化时间不当,致使细胞完全从皿/板底剥离的情况,不用吸出传代液,加入同等量的iPS完全培养基终止消化)。

6. 移入离心管,离心后重悬。传代比例为 1:8—1:12;冻存按 6 孔板每孔冻 1 支,

6cm 皿冻 2-4 支,10cm 皿冻 6-12 支,每支加入1mL的冻存液重悬。

7. 以1℃每分钟的速率降至-80℃过夜(一般常见商品化程序降温盒均可提供此条件)。

8.  -80℃过夜后,将冻存细胞转移至液氮保存。

细胞复苏:

1.  将iPS细胞复苏完全培养基取出并平衡至室温;取出包被过 iPS人多潜能干细胞铺底工作液的培养皿/瓶,吸去包被液并加入适量 iPS细胞复苏完全培养基,置于5% CO2的37℃恒温细胞培养箱中。

2.  37℃水浴解冻细胞,小心摇晃使细胞融化至仅剩一小块冰晶,迅速取出并用75%酒精消毒冻存管外表面,转移至无菌操作台中。

3.  将细胞悬液转移至新的15mL离心管中,缓慢加入4mL iPS细胞完全培养基,轻柔吹吸2次混匀。

4.  200g离心5分钟。

5.  弃上清,加入适量iPS细胞复苏完全培养基(含 10ul/ml的Y27632 因子)重悬细胞,轻柔吹吸2次混匀,并接种到准备好的培养皿中,显微镜下观察细胞呈4 ~ 10个细胞大小的团块。

6.  水平十字摇匀,5% CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时。

7.  弃掉iPS细胞复苏完全培养基,加入新鲜的iPS细胞完全培养基继续培养,每天更换新鲜的  iPS细胞完全培养基。其它体系培养的人ESC/iPSC的iPS培养条件的适应:

• Feeder体系上培养的人ESC/iPSC,按照标准步骤用iPS细胞消化液消化传代后接种到iPS 培养体系中,然后用标准iPS培养条件培养2 ~ 3代后,可适应iPS人多潜能干细胞培养基。

• 其他无饲养层条件培养的人ESC/iPSC可以在细胞状态良好时,换液直接转为iPS细胞培养基,然后用标准iPS培养条件培养2 ~ 3代后,可适应iPS细胞培养基。

疑难解答:

•是否还需要往iPS细胞完全培养基中补充或添加成分?

不需要。iPS细胞培养基中各个成分的质量和浓度都经过了最优化实验,完全支持人ESC/iPSC的长期培养,您无需再自行添加。

•培养基中有沉淀状物质是否是质量问题?

添加剂在解冻过程中,若有少量沉淀析出,属于正常现象,不影响使用,请充分混匀后与基础培养基混合。但添加剂不能在37℃解冻,否则会析出大量沉淀,影响培养基的效价。如果培养基中出现大量沉淀,请不要使用。

•是否能在37 ℃反复水浴iPS细胞完全培养基?

不能。频繁地在4℃和37℃之间转换会导致iPS细胞完全培养基中含有的因子失活,iPS细胞完全培养基在使用前平衡至室温即可。

• iPS细胞在传代后不贴壁怎么解决?

造成iPS传代后不贴壁的最可能的原因:

① 细胞消化时间不合适;②消化后吹打次数不合适,使得完成传代后细胞集落过大或过小。

• iPS分化怎么处理?

①细胞在刚复苏或传代时,小的细胞团不呈现标准的克隆形态,培养几天或传代后可恢复。②如果iPS分化的表现为干细胞克隆形态良好,克隆周边出现散在的分化细胞,可通过高比例传代(≥1:10),使得分化细胞的密度减少,低密度的分化细胞可被iPS培养体系筛选去除,如未完全去除,可用细胞刮或巴斯德管刮除。

③如果iPS分化的表现为克隆内部松散,边缘不平滑,在分化比例小或分化不严重的情况下,可通过连续传代2 ~ 3次恢复,如果分化严重,建议弃除。

• 细胞复苏率低是什么原因?

细胞复苏需使用iPS细胞复苏培养基,可大大提高细胞的复苏效率。复苏过程中,转移细胞、吹打混匀和重悬细胞时,吹打力度要轻柔,并尽量减少吹打次数,细胞接种后,即刻在显微镜下观察细胞团块的大小,4 ~ 10个细胞的团块为最佳。如果吹打力度过大或次数过多,

导致细胞分散成单细胞,细胞复苏率将偏低。


注意事项

仅限科研用。
培养体系中的一些组分是对人体健康有害的物质,请不要用暴露的皮肤接触培养体系的液体和有培养体系的液体残留的容器内部;这部分有害物质的浓度和危害性都较低,如有接触,立即用自来水冲洗即可。

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