产品描述

本产品为iCell团队精心优化的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒，可增强间充质干细胞向成软骨细胞分化的能力。

本产品仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床、家庭及其他用途。

产品组成成分及保存

Ø 注意：1.为保证产品的有效性，请避免反复冻融。

2. 诱导分化添加剂Ⅱ须现用现配，加入培养基后，须在12小时内用完，否则可能影响实验效果。

3. 配制好的诱导分化预混液（不含诱导分化添加剂Ⅱ）保存于2-8℃，有效期为2周。

产品使用说明（2D/3D培养）

1. 成软骨诱导分化培养基的配制

①室温条件下融化添加剂及血清。（注意：若添加剂或血清中有沉淀物，属正常现象，无须过滤，避免成分丢失。）

②配制诱导分化预混液：以下简称预混液。根据实验用量，于无菌操作台中配制。建议每次配制50mL，先加细胞基础培养基和胎牛血清，再加诱导分化添加剂。（配制比例见表一）

③配制诱导分化完全培养基：根据实验用量，按照1%的比例向预混液中添加诱导分化添加剂Ⅱ，如每1mL预混液添加10uL诱导分化添加剂Ⅱ。（注意：诱导分化添加剂Ⅱ须现用现加，配制完成的诱导分化完全培养基12h内使用完，否则将失效。）

2. 2D成软骨诱导分化实验步骤

①建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的间充质干细胞，将其消化下来，离心收集，使用含10%FBS的培养基调整细胞密度，均匀铺于培养瓶/板中。将接种好的细胞置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养。（细胞接种详情参考表二）

                                                                            表二

②待细胞汇合度达80%~100%时，即可进行诱导分化。

③小心吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入提前配制好的诱导分化完全培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。（注意：完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。）

④每2day~3day换用新鲜的诱导分化完全培养基。换液时，若细胞培养上清颜色变为澄清的黄色，是由于细胞量较大，培养基消耗较快导致的，请及时调整为每日换液。（注意：完全培养基加入前需提前置于37℃预热。）

⑤细胞诱导3周后，即可进行甲苯胺蓝染色鉴定。

3. 2D成软骨细胞甲苯胺蓝染色分析

①细胞诱导分化结束后，小心吸弃细胞培养上清，1×PBS润洗1~2次，室温固定30 min。（细胞固定液为4%中性甲醛溶液等，体积参考表二）

②吸弃细胞固定液，1×PBS润洗2次。沿孔壁缓慢加入甲苯胺蓝染色液，染液体积请参考表二，室温染色30min。（注意：染色液底部可能会有沉淀，吸取时尽量不要触及底部。若染色后有沉淀，1×PBS洗去即可。）

③吸出染色液，1×PBS润洗，去掉浮色。显微镜下观察细胞染色效果，背景呈淡蓝色，成软骨细胞呈紫红色。（注意：染色液可重复使用，建议收集。）

4. 3D成软骨诱导分化实验步骤

①建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的间充质干细胞，将其消化下来，计数。调整细胞浓度，按照每管3~4×105cell将细胞转移至15mL离心管中，20℃，250×g离心4min。

②弃上清，每管加入0.5mL预混液，重悬细胞沉淀。20℃，150×g离心5min。

③弃上清，每管加入0.5mL成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞沉淀，20℃，150×g离心5min。

④将离心管树立放置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，拧松离心管盖以便于气体交换。（注意：此步骤无需重悬细胞，且24h内不可晃动离心管。）

⑤约24h~48h后，细胞出现聚团现象，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮于培养液中。

⑥每2~3day换用新鲜的诱导分化完全培养基，持续诱导三周后，即可将培养液更换为固定液（4%中性甲醛），将软骨球固定，后续进行切片染色鉴定实验。

质量控制

ü 无菌检测（细菌、真菌和支原体检测）

ü pH测试

ü 渗透压检测

ü 内毒素

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