细胞介绍

HCT-15/FU为由HCT-15细胞构建的耐5-FU药物细胞株。

细胞特性

细胞运输、保存及注意事项

细胞培养试剂的配制

1）5-FU药物的配制及保存

建议将5-FU药物配制成20mg/mL的母液，即使用1mL 1M的NaOH溶液溶解20mg 5-FU药物，使其完全溶解。（若所购买的5-FU药物规格为10mg，则加入0.5mL 1M的NaOH溶液，待其完全溶解即为20mg/mL母液）

注意：可根据用量配置药物，并将药物分装保存，避免反复冻融导致药物失效。溶解后的5-FU，4℃保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存6个月。

2）冻存液的配制

90%优质胎牛血清+10%DMSO，现用现配。（冻存液中不含药物）

3）完全培养基的配制（推荐使用iCell-h073-001b）

细胞培养条件

气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%~80%。

细胞处理

1）冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4~6mL完全培养基的离心管中混合均匀，1000rpm/min离心3~5min，弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后，均匀铺于含6~8mL完全培养基的培养瓶（或皿）中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

注意：①细胞复苏过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞生长至汇合度达80%左右时，方可添加10~16ug/mL 5-FU药物；若细胞生长状态较为缓慢，可适当降低5-FU的浓度（首次降低一半药物浓度），或使用不含5-FU的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的5-FU浓度。

②建议复苏细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩，避免冻存管处于温差较大情况下发生爆炸，造成人员伤害。

2）细胞传代（建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1：2比例传代）

①待细胞密度达到80%~90%时，即可进行传代培养。

②弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次，吸净残余的PBS。

③加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化2~5min，显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落，即可轻拍培养瓶至细胞全部脱落。迅速拿回操作台，加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化。 

④将细胞悬液移入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清液。

⑤向细胞沉淀中加入1~2mL完全培养基重悬细胞，轻吹混匀。将细胞悬液按1：1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中，添加6~8mL完全培养基。

注意：细胞传代1~2次后仍能保持增殖，即可提高药物浓度至20ug/mL继续培养；若此过程中细胞停止增殖，且状态较差，则需降低药物浓度（首次降低一半药物浓度）或使用不含药物的完全培养基培养，至细胞汇合度约80%，且生长状态较好时，再更换为所需的5-FU药物浓度。

3）细胞冻存

①细胞冻存时，步骤同2）细胞传代的①~④，细胞计数后，加入配制好的细胞冻存液，重悬细胞，按照1×10^6 ~ 1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

注意：细胞冻存过程中，不可添加药物。

②将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。